酵母表达系统兼有原核和高等真核系统的优点，具备培养条件普通、生长速度快、成本相对较低、能进行蛋白翻译后加工、易获得可溶性活性重组蛋白等特点，被广泛用于重组蛋白尤其是真核蛋白的生产制备。其中巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)因其生长速度快、商业化表达载体丰富、可获得高效的分泌表达等优点，使其成为酵母表达重组蛋白的优先选择。

　　1 穿梭载体构建 1-2周 可选择不同载体，不同亲和标签(His，Fc)，分泌或胞内表达;本公司可免费提供pPIC9K、pPICZaA分泌表达载体，同时可根据客户要求及靶蛋白较小(小于8Kd)等特殊情况，向客户提供本公司自行构建的pPIC9K-SUMO(mutation)载体，从而大幅提高表达水平及克服小蛋白易降解、不易纯化等特点(需加收1500元);

　　2 质粒线性化及电转毕赤酵母 1周 根据客户要求及基因特点，选择合适的限制性内切酶线性化重组质粒并电转入毕赤酵母GS115或X-33，并得到预期甲醇利用表型的转化子;

　　3 高拷贝酵母转化子筛选(可选) 2-3周 若选择GS115/pPIC9K系统，第一轮营养缺陷筛选完成后进行G418抗性筛选(eg:0.5mg/mL、1mg/mL、2mg/mL);若选择X33/pPICZaA系统，本步骤与步骤2合并在一次梯度加压筛选过程中;

　　4 酵母阳性转化子的PCR鉴定 1周 挑取数株高拷贝酵母转化子， 抽提对应基因组DNA后使用PCR对其进行鉴定(使用引物5AOX1和3AOX1可同时鉴定转化子甲醇利用表型)

　　5 重组蛋白的诱导表达及分离纯化 1周 挑取数株高拷贝酵母转化子(5-10株)小量诱导表达(甲醇作为诱导剂)，分不同时间点收集酵母诱导上清进行SDS-PAGE电泳检测或Dot-blot分析，从而确定最佳收样时间，最高表达量的酵母转化子(同步骤3可进行相互佐证);

　　6 重组蛋白的分离纯化 1周 选用合适的色谱方法纯化重组蛋白，较常用的色谱方法有：亲和层析(Ni、proteinA)、阴、阳离子交换层析(Q、SP)、分子排阻层析等;

　　7 重组蛋白的QC分析 1周 SDS-PAGE电泳检测重组蛋白纯度、BCA定量重组蛋白的浓度、Western-blot检测重组蛋白的免疫原性、

　　案例展示：某重组酶在毕赤酵母中的分泌表达(GS115/pPIC9K系统)

　　背景：重组酶基因经无缝克隆技术装入pPIC9K载体，电转毕赤酵母GS115，涂布MD平板初筛，然后挑取MD平板上若干酵母转化子(>300株)进行G418梯度筛选(G418浓度设0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml三个梯度)，最后从含有不同G418浓度的平板上挑得8株酵母转化子，进行甲醇诱导表达，3d后收获各转化子表达上清进行SDS-PAGE电泳检测。

　　结论：从图中可以看出8株酵母转化子的表达水平排序为：转道1,3>轨道2,4>轨道5,6,7,8，根据表达水平的横向比较，结合Bandscan软件的灰度扫描结果，很大可能性是：转道1和轨道3对应的酵母转化子整合有相同拷贝数的外源基因，转道2和轨道4对应的酵母转化子整合有相同拷贝数的外源基因，转道5、6、7、8对应的酵母转化子整合有相同拷贝数的外源基因。